Er begann sein Medizinstudium in Straßburg bei den Professoren Schwalbe und Hoppe und setzte es dann in Königsberg fort. Hier konnte er die Vorlesungen von Professor Eiselsberg besuchen. In einem Brief vom Mai 1897 beschreibt er den Chirurgen Eiselsberg als sehr rührigen, nicht phlegmatischen Arzt und Lehrer. Im selben Brief an seinen Vater bezieht er sich noch auf einen weiteren Königsberger Lehrer, von dem er sogar eine Skizze anfertigt: den Internist Prof. Ludwig Lichtheim. Von ihm erhält er die ersten Informationen über die Entdeckung der X-Strahlen durch Wilhelm Conrad Röntgen in Würzburg.

Während Holzknecht noch in Königsberg studierte, hatte man in Wien schon mit umfangreichen röntgenologisch-medizinischen Untersuchungen begonnen. Namen wie Franz und Siegmund Exner und die II. Medizinische Klinik des Wiener Allgemeinen Krankenhauses sind eng mit diesem Vorgang verbunden.Zu erwähnen sind auch die Physikochemiker Eder und Valenta sowie der Physiker Ernst Mach, die schon 1896 Röntgenbilder von Kleintieren und menschlichen Gliedmaßen erstellten.

Holzknecht mit einer Gruppe früher Mitarbeiter
hinter dem Fluoroskop

1899 noch als Student begann Holzknecht an der Klinik mit röntgenologischen Untersuchungen. Die Geräte hatte er sich privat mit finanzieller Unterstützung der Mutter besorgt. In einem winzigen Raum zwischen zwei Krankensälen, dem sogenannten "Pestkammerl" (in dem sich seinerzeit der Arzt Franz Müller mit der Lungenpest infiziert hatte) entstanden in kurzer Zeit grundlegende Arbeiten zur Radiologie. Die Arbeiten waren so sensationell, dass Holzknecht noch als Student in der Gesellschaft der ärzte eine Demonstration abhalten durfte. Am 9. Juli 1899 beendet er sein Studium mit der Promotion zum "Doktor der gesamten Heilkunde". Die Namen von drei großen ärzten sind untrennbar mit Holzknechts Lebensweg verbunden: Eiselsberg, Lichtheim und Nothnagel.

Unter Hermann Nothnagel, dem Vorstand der I. Wiener Medizinischen Klinik, wurde Holzknecht Aspirant und 1902 Sekundararzt zur Bedienung des ersten Röntgenapparates (den ja seine Mutter mitfinanziert hatte. 1904 wurde er schließlich zum Abteilungsassistenten ernannt und übernahm 1905 die Leitung des Labors.

Um die Jüdin Marianne Singer heiraten zu können, trat Holzknecht 1910 aus der röm.-kath. Kirche aus. Die Ehe wurde in Wien in der Synagoge in der Seitenstettengasse ordnungsgemäß registriert, war aber nicht von Dauer und endete in Scheidung.

Holzknecht in seinem Element

1914 gründete Holzknecht das Zentral-Röntgen-Laboratorium des Wiener Allgemeinen Krankenhauses (das spätere "Guido-Holzknecht-Institut"), das in darauffolgenden Jahren weltweit berühmt wurde und letztlich als Ausbildungszentrum internationalen Ruf erlangte. Ausländische Röntgengesellschaften kamen nach Wien, um an Holzknechts Labor zu lernen. Daneben gründete er auch noch eine Röntgenschwesternschule sowie die Wiener Röntgentechnische Versuchsanstalt. Während des 1. Weltkrieg diente Holzknecht als Oberstleutnant in der k.u.k.-Armee, wo er sich voll für Organisation und Entwicklung des Bestrahlungseinsatzes und der Lösung von medizinischen Problemen im Zusammenhang mit dem Krieg einsetzte.

Chromoradiometer, vorgestellt auf dem zweiten
"International Congress of Electrology", Bern, 1902

Tragischerweise war den Pionieren dieser neuen epochemachenden medizinischen Technik die schädigende Wirkung der Röntgenstrahlen nicht vollständig bewusst. Immerhin jedoch erkannte Holzknecht den engen Zusammenhang der Hautschädigung mit Dauer und Intensität der Bestrahlung. Mit dem von ihm bereits 1902 konstruierten Chromoradiometer konnten die Strahlungsschäden an seinem Institut um etwa 90% vermindert werden. Dennoch hatte die intensive Strahlung an seinen Händen zu Röntgenkrebs geführt. Der Amputation eines Fingers im Jahr 1910 folgten noch zahlreiche Operationen an den Händen und Armen.

Diesen Leidensweg durchschritt Holzknecht mit beinahe stoischer Gelassenheit und ließ sich schließlich noch spezielle Armprothesen anfertigen, um weiterarbeiten zu können. Nach 64 zum Teil schweren Operationen verstarb Holzknecht am 31. Oktober 1931 durch Röntgenkrebs.